컬럼비아 기후대 연구팀, SRS 현미경 개발 생수 3종 조사…미국 『국립과학원회보』 게재

플라스틱 입자, 생수 1L당 11만〜37만개 검출…나노 플라스틱이 90% 차지

나노 플라스틱, 크기 작아 혈액·세포로 유입될 수 있어…나노독성학 연구 필요
 

매년 플라스틱의 소비가 증가하면서 플라스틱 오염에 대한 전 세계적인 우려가 증가하고 있다. 전 세계 플라스틱 생산량은 연간 4억 미터톤(Metric Ton)에 육박하고 있으며, 매년 3천만 톤 이상이 물이나 땅에 버려지고 있다. 합성섬유를 비롯해 플라스틱으로 생산된 제품은 사용 중에도 입자를 배출한다.

특히, 플라스틱 폴리머(Plastic Polymer)는 분해되면서 미크론(μ) 수준에서 멈추지 않고 많은 양의 나노 플라스틱을 생성한다. 하지만 기존의 기술 수준으로 나노 플라스틱을 분석하는 데는 한계가 있다.  

실제 환경에서 검출되는 나노 플라스틱은 실험실에서 조작된 나노 플라스틱 입자와 달리 본질적으로 라벨이 없고 화학적 조성(Chemical Composition)과 입자 형태 모두에서 상당한 이질성을 가지며, 이는 상응하는 다른 독성 영향을 견딜 수 있음을 시사한다.

이러한 이질성과 기술적 한계로 미지의 영역인 나노 플라스틱의 발생원, 존재도(Abundance), 거동(Fate) 및 잠재적 독성에 관한 기존 지식의 공백을 메우려면 앙상블 측정(Ensemble Measurement)으로 인한 정보 손실을 방지하기 위해 화학적 특이성을 갖춘 단일 입자 이미징이 필수적이다. 하지만 FT-IR 또는 라만 현미경 검사(Raman Microscopy)라고 불리는 기존의 단일 입자 화학적 이미징(Chemical Imaging) 기술은 상대적으로 낮은 기기 분해능 및 검출 감도로 인해 미세 플라스틱 수준에서만 이질성을 나타내는 데 그쳤다.

전자 현미경 및 원자 힘 현미경과 같이 플라스틱 입자에 대해 나노 감도를 갖는 입자의 이미징 기술은 다양한 구성 요소를 식별하는 데 중요한 화학적 특이성이 부족하다. 광범위한 노력이 이뤄졌지만 대부분의 기법은 분석 과학 분야에서 반복되는 주제인 감도와 특이성의 상충 관계의 균형을 깨지 못했다. 최근 AFM-IR 및 STXM에 의해 입증된 화학적 분광법을 사용한 단일 입자 이미징은 충분한 입자를 가진 환경 마이크로 나노 플라스틱을 정량화하기에는 처리량이 너무 낮다. 즉, 실제 시료에서 나노 플라스틱을 분석하기 위해서는 △단일 입자 분석의 감도 △특이성 △처리량 등 세 가지가 중요하다.

Plastic pollution has been a rising global concern, with increasing plastic consumption every year. Microplastic contaminations have been identified to prevalently from almost everywhere in the environments and even human biological samples. Moreover, mounting discoveries suggest that the fragmentation of plastic polymer does not stop at the micron level but rather continues to form nanoplastics with expected quantities orders of magnitude higher. With engineered plastic particles with fluor escent dyes or metal labels, researchers have shown the possibility of nanoplastics crossing biological barriers and entering the biological systems, raising public concern on its potential toxicity.

Despite the urge to assess the concern, nanoplastics analysis remains challenging with traditional techniques. Unlike engineered nanoparticles prepared in laboratory as model systems, real nanoplastics in the environment are intrinsically label-free and have significant heterogeneity in both chemical composition and particle morphologies, which are likely to endure correspondingly different toxicity implications. To address the existing knowledge gap on nanoplastics regarding their source, abundance, fate, and potential toxicity encoded in such a heterogeneous population, single-particle imaging with chemical specificity is undoubtedly essential to avoid informational loss from ensemble measurement. However, traditional single-particle chemical imaging techniques, namely FTIR or Raman microscopy, suffer from relatively poor instrumental resolution and detection sensitivity, which limit their success in revealing the heterogeneity only at microplastic level. Particle imaging techniques with nano-sensitivity for plastic particles, such as electron microscopy and atomic force microscopy, lack the crucial chemical specificity to distinguish different compositions. Extensive efforts have been made; however, most techniques are still bound by the fundamental trade-off between sensitivity and specificity, a recurring theme in analytical science. Single-particle imaging with chemical spectroscopy, recently demonstrated by AFM-IR and STXM , tends to have too low throughput (> 10 min/μm2 with spectra for plastic identification) to quantify environmental micro-nano plastics with sufficient particle statistics. In summary, sensitivity, specificity, and throughput of single-particle analysis are the three crucial requirements to analyze nanoplastics in real-life samples.

컬럼비아 기후대학교 연구팀, SRS 현미경 개발

컬럼비아 기후대학교 연구팀은 이 세 가지 조건을 충족하는 강력한 나노 플라스틱 검출 플랫폼인 데이터 과학 중심의 초분광 유도 라만 산란(SRS) 현미경을 개발했다. SRS 현미경은 이미징 대조(Contrast) 메커니즘으로 유도 라만 분광법을 활용하며, 생물 의학 이미징(Biomedical Imaging)에서 유용성이 증가하는 것을 발견했다. 유도 라만 산란은 일반적인 라만 이미징을 1천 배 이상 빠르게 처리해 미세 플라스틱을 빠르게 식별할 수 있는 것으로 알려졌지만 나노 플라스틱 분석에 대한 유용성은 아직 부족하다.

연구팀은 단일 입자 검출에 필요한 감도를 최대화하기 위해 유도 빔(Stimulating Beam)의 모든 에너지를 집중시킨 협대역 SRS 이미징 기법을 채택했다. 그러나 검출 한계를 초과하는 가장 강한 진동 특징에서 나오는 제한된 스펙트럼의 특성은 처리량이 많은 플라스틱 입자에 필수적인 자동화된 스펙트럼 식별에 어려움을 초래한다. 이러한 근본적인 감도-특이성의 상충 관계를 해결하고 초분광 SRS 이미징을 최대한 활용하기 위해 연구팀은 △PA(폴리아미드) △PP(폴리프로필렌) △PE(폴리에틸렌) △PMMA(폴리메타크릴산메틸) △PVC(폴리염화비닐) △PS(폴리스틸렌) △PET(폴리에틸렌테레프탈레이트) 등 일반적인 플라스틱 표준 7종의 스펙트럼 라이브러리를 기반으로 하는 데이터 기반 SRS 맞춤형 스펙트럼 매칭 알고리즘을 고안했다. 데이터 과학의 도움을 받아 나노 플라스틱 검출을 위한 자동화된 폴리머 식별을 위해 SRS 분광기 모양의 진동 신호에서 발생하는 고유의 화학적 특이성을 성공적으로 복구했다.

연구팀은 이 플랫폼을 통해 매일 소비되는 생수에 함유된 미세 나노 플라스틱에 대해 연구했다. 라이브러리에서 7종류의 플라스틱 폴리머 모두에 대한 개별 입자가 식별돼 100〜200나노미터(nm) 크기의 플라스틱 입자를 통계적으로 분석할 수 있었다. 미세 나노 플라스틱에 대한 노출은 특정 폴리머 합성물을 통해 추정됐다. 이미징의 형태학(Morphology, 形態學)적 정보를 통합해 개별 플라스틱 입자의 다차원 특성이 나타나 우리를 둘러싸고 있는 숨겨진 마이크로 나노 세계에서 플라스틱 입자의 전반적인 이질성이 드러났다.

Herein, we introduce a data science-driven hyperspectral stimulated Raman scattering (SRS) microscopy as a powerful platform of nanoplastics detection to meet the three requirements. SRS microscopy utilizes stimulated Raman spectroscopy as the imaging contrast mechanism and has found increasing utility in biomedical imaging. While SRS is often credited for speeding up regular Raman imaging by over 1,000 times, which enables fast identification of microplastics, the utility for it to analyze nanoplastic remains to be explored. To maximize the sensitivity needed for single-particle detection, we adopted a narrowband SRS imaging scheme by focusing all the energy of the stimulating beam to target characteristic vibrational modes with the largest Raman cross-sections. We then showed that, both theoretically and experimentally, narrowband SRS imaging can enable the detection of nanoplastic as small as 100 nm. However, the limited spectral features from only the strongest vibrational signatures above the detection limit impose challenges on automated spectrum identification, which is essential for high-throughput plastic particle analysis. To address this fundamental sensitivity-specificity trade-off and unleash the full potential of hyperspectral SRS imaging, we devised a data-driven SRS-tailored spectral matching algorithm based on the spectral library of seven common plastic standards. The intrinsic chemical specificity from vibrational signatures in the shape of SRS spectroscopy is successfully recovered for automated polymer identification for nanoplastic detection with the help of the data science.

Equipped with this platform, we then studied micro-nano plastics in daily consumed bottled water as a prototype of a real-life sample. Individual particles for all seven plastic polymers from the library were identified, enabling statistical analysis of plastic particles with sizes down to 100 to 200 nm. The exposure to micro-nano plastics was estimated with a specified polymer composition. Integrating morphological information from imaging, multi-dimensional characterizations of individual plastic particles are reported, unveiling the all-around heterogeneities of plastic particles in a hidden micro-nano world encircling us.

초분광 SRS 이미징 플랫폼 구축해 미세나노 플라스틱 식별

미세 플라스틱은 식품, 음료 및 제품 포장 등에서 발견되고 있으며, 이 중 생수는 일생 생활에서 매일 섭취한다는 점에서 미세 플라스틱의 인체 유입의 주요 원인으로 많은 관심을 받고 있다. 그간 분석 과학의 감도-특이성 간의 상충 관계로 인한 지식의 부족으로 인해 지식 수준은 미세 플라스틱에 그쳐 나노 플라스틱은 미지의 영역으로 남아 있다. 현재까지 나노 플라스틱은 생수에서 농축된 나노 플라스틱의 앨리쿼트(Aliquot)를 분석하기 위해 다양한 기법을 사용한 앙상블 특성화만 보고됐다. 단일 입자 수준에서 나노 플라스틱 오염의 본질적인 이질성을 다루기 위해서는 정보가 필요하다. 이에 연구팀은 SRS 현미경으로 나노 감도의 신속한 단일 입자 화학적 이미징을 통해 포괄적인 마이크로 나노 플라스틱 특성화를 위한 간결한 워크플로(Workflow)를 개발했다. 이를 통해 단일 측정으로 많은 정보를 획득해 화학 조성과 형태학의 동시 발생의 특성화(Simultaneous Characterization)를 달성할 수 있으며, 높은 처리량의 단일 입자 분석을 통한 다차원 통계가 가능해졌다.

연구팀은 실제 시료를 분석하기 위해 막 표면에 특정 크기 이상의 입자를 수집하는 일반적인 여과 방식에 주목했다. 산화알루미늄(Aluminum Oxide) 막은 목표 스펙트럼 윈도(Target Spectral Window)에서 최소한의 배경을 가지며 진동 분광법과 높은 호환성을 보여준다. 연구팀은 불투명해 보이는 산화알루미늄 막에 중수(重水)를 사용해 굴절률 불일치를 줄임으로써 투명한 이미징 윈도(Imaging Window)로 쉽게 변형시킬 수 있다. 이를 통해 연구팀은 허용 가능한 신호(기존 감도의 〜70%)를 유지하는 SRS 이미징을 생성했다.

연구팀은 중수로 제조된 아가로스 겔(Agarose Gel)을 사용해 막 표면에 입자를 수집했으며, 이를 통해 최소한의 이미징 배경을 가진 개별 입자의 정상(定常) SRS 이미징이 가능해졌다. 이러한 방식의 간결한 시료 전처리는 기존 여과막의 고품질 SRS 이미징에 충분하며, 시료 건조 또는 이동 과정에서 시료 손실과 오염을 방지할 수 있다.

연구팀은 각 시료에 대해 SRS 현미경을 통한 초분광 이미징을 위해 수집 영역 내 5개의 시야(FOVs)에서 무작위로 샘플링했다. 각 FOVs에서 마이크로 나노 플라스틱은 개발된 알고리즘과 검증된 하한계 조건을 사용해 입자 분할 및 플라스틱 식별을 자동으로 수행하는 통합 데이터 분석 워크플로에 의해 감지됐다. 그 후 초분광 SRS 이미징에서 얻은 개별 플라스틱 입자의 형태학적 및 화학적 정보를 결합해 고차원 프로파일링을 생성했다.

 연구팀은 세 가지 다른 브랜드의 생수를 분석했다. 연구팀은 실험실에 플라스틱이 함유되지 않은 물(Plastic-free Water)을 확보할 수 없어 아노디스크(Anodisc) 필터를 사용해 대조 실험과 동일한 방식으로 측정했다. 그 결과, 라이브러리의 플라스틱 폴리머 7종에 대한 개별 입자가 명확하게 감지됐으며, 연구팀은 데이터 기반 초분광 SRS 이미징 플랫폼의 강력한 플라스틱 식별 기능을 입증했다.

With the platform established, we moved on to apply the utility to study micro-nano plastics from real-life samples. Microplastics have been widely found in human foods, drinks, and product packaging, among which bottled water is of particular interest for being an important source of microplastics to be ingested in daily life. Limited by the sensitivity-specificity trade-off in analytical science, the literature knowledge is constrained to microplastics in bottled water, leaving the nanoplastics mostly uncharted. So far, only ensemble characterizations using combinations of techniques are reported to analyze the aliquots of concentrated nanoparticles from bottled water. Information is demanded to address the intrinsic heterogeneity of nanoplastics contamination at a single-particle level. Here, we report a concise workflow for comprehensive micro-nano plastics characterization enabled by rapid single-particle chemical imaging with nano-sensitivity by SRS microscopy. Rich information can be acquired from a single measurement to achieve simultaneous characterization of chemical composition and morphology, enabling multi-dimensional statistics through high-throughput single-particle analysis.

Filtration is one of the most common methods to collect particles above certain sizes onto a membrane surface. It would be highly preferable for analyzing real-world samples if the collected membrane is directly compatible for SRS imaging. Aluminum oxide membranes have minimal background in the target spectral window and have shown good compatibility with vibrational spectroscopy. The seemingly opaque aluminum oxide membrane can be easily transformed into a transparent imaging window by applying heavy water to reduce refractive index mismatch. This resulted in transmissive SRS imaging with acceptable signal retention. Embedding the particles on the membrane surface in situ with agarose gel prepared with D2O further enabled stationary SRS imaging of individual particles with minimal imaging background. In this way, a concise sample preprocessing is enough for high-quality SRS imaging of the original filtration membrane, avoiding undesirable sample loss or contamination in any complicated sample drying or transferring processes.

The established workflow for analyzing micro-nano plastics exposure from bottled water with hyperspectral SRS imaging is presented in Fig. 3. For each sample, five or more fields of views (FOVs) were randomly sampled within the collecting area for hyperspectral imaging under SRS microscopy. In each FOV, micro-nano plastics were detected by an integrated data analysis workflow that automatically performed the particle segmentation and plastic identification with the developed algorithms and validated threshold conditions. Morphological and chemical information of each individual plastic particle obtained from the hyperspectral SRS images was then combined to provide high-dimensional profiling. Following the procedure, we analyzed bottled water from three different brands acquired at the same time from a large retailer. With no access to plastic-free water in the lab (SI Appendix, Supplementary Note 6), the Anodisc filters are prepared and measured in the same way as blank control. In the results, we were able to detect individual particles for all seven plastic polymers in the library unambiguously by spectral matching with their corresponding bulk standards, demonstrating the powerful plastic identification capability of our data-driven hyperspectral SRS imaging platform.

미국 생수 3종서, 플라스틱 입자 최대 37만개 발견

식별된 플라스틱 폴리머로 구성된 단일 입자 이미지를 통한 정량화는 생수에서 미지의 나노 플라스틱의 분석 파노라마를 구축하기 위한 다차원 정보를 제공한다. 입자 정량화 결과, FOVs(0.2㎜×0.2㎜)에서 3개의 브랜드 생수에는 각각 평균 78〜103개의 플라스틱 입자가 확인됐으며, 이는 바탕 시료보다 높은 것으로 나타났다. 막 표면에 미세 나노 플라스틱의 입자가 균일하게 분포한다고 가정하면 생수에서 미세 나노 플라스틱의 노출 정도를 추정할 수 있다. 연구팀은 3개 브랜드 외 다른 브랜드에서 측정한 생수 1L당 약 11만〜37만(2.4±1.3×105) 개의 입자가 함유된 것으로 추정했다. 이는 기존 2018년 연구에서 생수 1L당 평균 325개의 입자(<1㎛) 대비 338〜1천138배 높은 수치다.

연구팀은 각 유형의 폴리머 개별 입자를 별도로 분석해 화학적 이질성을 밝히기 위해 분석했다. 그 결과 라이브러리 내에 PA, PP, PET, PVC, PS는 생수 내 미세 나노 플라스틱 노출에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 미세 나노 플라스틱의 정확한 화학 성분은 생수 브랜드마다 차이가 있었지만 연구팀이 분석한 3개 브랜드 모두에서 PA가 가장 많아 주요 원인인 것으로 나타났다.

Quantification from single-particle images with identified plastic polymer composition provides multi-dimensional information to build the analytical panorama of underexplored nanoplastics in bottled water.

Number quantification through particle counting suggests that on average, 78 to 103 plastic particles were identified in each FOV (0.2mm × 0.2mm) for three different brands, which was significantly higher (P < 0.001) than the blank samples. Assuming a uniform distribution of micro-nano plastic particles on the surface of the membrane region (SI Appendix, Supplementary Note 5), we can make an estimation for the micro-nano plastic exposure from bottled water. We estimate that there are on average about 2.4±1.3×105 plastic particles ingested from every liter of bottled water measured from different brands. Individual particles of each type of polymer are analyzed separately to reveal chemical heterogeneity. Within the library, PA, PP, PET, PVC, and PS are found likely to play a significant role in micro-nano plastics exposure from bottled water. The exact chemical composition of the micro-nano plastics varied from brand to brand, but PA seem to be the common major contributors in number among all the three brands we analyzed.

생수 1L당 미세 나노 플라스틱 10나노그램 함유

SRS 강도와 피분석물의 양 사이의 선형 관계를 활용해 입자 수 외에 질량도 추정할 수 있다. 질량 교정 곡선(Calibration Curve)은 표준 PS 나노구체를 통한 선형 관계로부터 밀도 및 상대적인 SRS 강도를 벗어난 각 폴리머에 대해 추정할 수 있다. 따라서 각 입자에 대한 관심 영역(ROI) 내의 적분 강도(Integrated Intensity)는 질량으로 변환된다. 질량에서 추정된 미세 나노 플라스틱 노출량은 약 10ng/L 수준으로 계산된다.

화학적 조성을 통해 질량을 분석하면 질량으로 정량화된 나노 플라스틱과 입자수로 정량화된 나노 플라스틱 간의 큰 차이가 있다. C 브랜드의 경우, PS 나노 플라스틱이 입자 수는 압도적으로 많았지만 질량은 극히 일부에 불과하고, PET가 가장 많은 것으로 나타났다. 이러한 차이는 실제 시료에서 미세 나노 플라스틱의 이질적인 특성에서 비롯된 집단적 입자 특성화로 인한 플라스틱 구성에 대한 잠재적인 오해를 조명한다.

SRS 현미경을 통해 구현된 개별 입자의 형태학적 특성은 다른 차원의 입자 이질성을 직접적으로 보여준다. 본질이 잘 정의된 개별 미세 나노 입자의 이미지로부터 입자 크기와 형태에 대한 통계적 분석이 기록된다. 크기 분포를 측정할 때, 강도 측정값에서 입자를 고체 구로 가정하고 입자의 부피와 SRS 신호 사이의 선형 관계로 보정하면 회절 한계(Diffraction Limit) 미만의 입자를 특성화할 수 있다. 그 결과, 연구팀은 서로 다른 화학적 조성을 가진 플라스틱 입자가 실제로 서로 다른 크기 분포 패턴을 가지고 있음을 발견했다. 입자의 이질성을 직접 관찰하면 질량이나 수량 측정에서 관찰된 화학적 조성의 차이를 자연스럽게 설명할 수 있다. PS와 PET를 예로 들면, PS 입자의 크기 분포는 약 100〜200nm인 반면, PET 입자는 약 1〜2㎛이기 때문에 입자 수는 PS가 압도적이지만 질량은 PET가 더 많이 차지한다.

Harnessing the linear relationship between SRS intensity and the amount of analytes within the focal volume, we are also able to provide an estimation of exposure in mass besides particle number. The mass calibration curve can be estimated for each polymer out of density and relative SRS intensity from the linear relationship obtained by standard PS nanospheres. Integrated intensity within the region of interest for each particle is thus converted to mass. The estimated micro-nano plastic exposure in mass is calculated to be at the level of around 10 ng/L. Analyzing the chemical composition in mass, we find unneglectable differences between contribution quantified by mass and contribution by number. Take the results from Brand C as an example. The PS nanoplastics though dominated in particle number, only account for a minor portion of the mass. Instead, PET becomes the major contributor together in mass. Such seeming disparity highlights the potential misunderstanding of plastic composition from collective particle characterization, which originated from the heterogeneous nature of micro-nano plastics from real-world samples.

Morphological characterization of individual particles enabled by SRS microscopy directly reveals another dimension of particle heterogeneity. Statistical analysis of particle size and shape from the images of individual micro-nano particles with well-defined identities is reported. When measuring the size distribution, we are able to characterize particles below the diffraction limit by extrapolating the size from the intensity reading (assuming the particles as solid spheres) and by using the linear relationship between the volume of the particles and SRS signal as calibration. As a result, we find that plastic particles of different chemical compositions actually have different size distribution patterns. The direct observation of the particle heterogeneity here provides a natural explanation of chemical compositional differences observed from mass or number measurement. Take PS and PET as an example: the size distribution of PS particles centers around 100 to 200 nm, whereas PET particles tend to have a size distribution that nears 1 to 2 microns, which explains why PET is a more significant component when measuring in mass while PS clearly dominates when counting the number of particles.

미세 나노 플라스틱, 다양한 형태학적 특성 가져

형태는 형태학적 특징과 별개로 나노독성(Nanotoxicity) 측면에서 중요하다. 연구에 따르면 형태는 미세 나노 입자가 인체 세포에 흡수되는 데 중요하다. 연구팀은 플라스틱 입자의 SRS 이미지를 통해 생수에서 다양한 형태의 미세 나노 플라스틱을 확인했다. 연구팀은 플라스틱 입자의 형태를 통계적으로 설명하기 위해 회절 한계 이상의 개별 입자에 대해 종횡비를 측정했다. 종횡비는 나노독성학 연구에서 널리 인정받고 있다. 

검출된 플라스틱 입자의 평균 종횡비는 1.7로, 종횡비가 3 이상인 입자의 경우 섬유질 형태이며, 종횡비가 1.4 미만인 입자는 대부분 구체 형태였다. 연구팀은 플라스틱 입자의 형태 변화는 검출된 모든 폴리머에서 발견했으며, 실제 미세 나노 플라스틱은 다양한 형태학적 특성을 가지고 있다는 것을 확인했다. 이는 실험실에서 연구에 사용되는 조작된 고분자 나노입자와 유사하지 않았으며, 실제 플라스틱 입자 노출과 관련된 독성학적 결과 및 다양한 물리화학적 특성은 아직 결정되지 않았다.

The shape is another important morphological feature that matters as a critical aspect of nanotoxicity. Studies have shown that shape plays a role in determining the cellular uptake of micro-nano particles. SRS images of plastic particles confirmed the existence of shape diversity for micro-nano plastics in bottled water. To account for the shape of plastic particles in a statistical manner, we measure the aspect ratio of individual particles above the diffraction limit. The aspect ratio is widely acknowledged in nanotoxicology studies. The aspect ratio of the plastic particles detected ranges from 1 to 6, and the average aspect ratio for particles is around 1.7. Fig. 6 I-M provides a pictorial view of how the aspect ratio is related to the particle shape. Particles with an aspect ratio of above 3 are most likely to be fibrous in shape, while particles with an aspect ratio of below 1.4 will be largely spherical. Shape variation on plastic particles has been found in all polymers detected, confirming the widely recognized idea that real-world micro-nano plastics have diverse morphological prosperities. This dimension is hard to be resembled by engineered polymer nanoparticles commonly studied in research laboratories, and the toxicological consequences pertaining to real-life plastic particle exposures and their differing physicochemical properties (i.e., size, shape) have yet to be determined.

미세 나노 플라스틱, 생수 1L당 105개 입자 추정

일반 생수에서 미세 나노 플라스틱 노출 수준은 리터당 105개 입자 수준으로 추정되며, 이는 이전에 보고된 미세 플라스틱에만 초점을 맞춘 결과보다 2〜3배 더 큰 수치다. 인체 노출 추정과 관련해 이러한 수치는 기존 학계에 보고된 것보다 상당히 높으며, 이는 새로 감지된 플라스틱 입자의 나노 플라스틱 파편으로 인한 결과다. 기존 이미징에서 볼 수 없었던 작은 입자가 실제로 수가 많고 감지된 전체 플라스틱 입자 개체군의 최대 90%를 차지한다. 미세 플라스틱으로 확인된 나머지 10%의 농도는 L당 약 3×104개 입자이며, 대부분은 2㎛ 미만의 크기이다. 일반 광학 현미경으로 식별하기 더 쉬운 더 큰 입자(>2㎛)는 다양한 기술을 기반으로 기존에 보고된 검출 한계에 따라 기존 미세 플라스틱 분석과 같은 크기다. 

연구팀의 결과는 실제 시료에서 나노 플라스틱을 명확하게 감지해 미크론 수준 이상의 플라스틱 분열을 확인했다. 자연계의 다른 많은 입자 크기 분포와 유사하게 기존 입자 이미징 기술에서 보이지 않거나 식별되지 않았지만 기존에 예상된 것보다 훨씬 많은 나노 플라스틱이 존재한다. 더 작은 크기의 나노 입자에는 입방체가 없는(Cubic-less) 물질이 포함되어 있기 때문에 나노 플라스틱 개체군을 정량화할 때 쉽게 간과할 수 있다. 하지만 이러한 입방체가 없는 나노 플라스틱 입자가 생물학적 장벽을 통과하는 능력을 고려하면 이러한 나노 입자가 독성 평가 측면에서 주요 역할을 할 수 있다.

By developing the data-driven hyperspectral SRS imaging platform for micro-nano plastic analysis, we describe a methodology to improve nanoparticle detection sensitivity and polymer identification specificity, which has allowed us to start to address the long-lasting knowledge gap of nanoplastics. We estimate that the exposure to the micro-nano plastics from regular bottled water was at the level of 105 particles per liter, which is two to three orders of magnitude more than the previously reported results merely focusing on large microplastics. As it pertains to the estimation of human exposure, these values are substantially higher than those currently reported in the literature, which is a result from the newly detected nanoplastic fraction of plastic particulate. The tiny particles previously invisible under conventional imaging actually dominate in number and account for ~90% of the entire population of plastic particles detected. The remaining 10% identified as microplastics have a concentration of around 3 × 104 particles per liter, with the majority of them in the size below 2㎛. Larger particles(> 2㎛), which are easier to identify under regular optical microscopy, are in the same order of magnitude as the reported microplastic analysis depending on the detection limited reported based on different technologies. 

Our results confirm the plastic fragmentation beyond the micron level by unambiguously detecting nanoplastics in real-life samples. Similar to many other particle size distributions in the natural world, there are substantially more nanoplastics, despite being invisible or unidentified under conventional particle imaging techniques, than previously counted large micron ones. This population of nanoplastics can be easily overlooked in mass quantification as well since nanoparticles with smaller sizes contain cubic-less substances. However, given the capability of these nanoplastic particles to cross the biological barrier, nanoparticles, despite the seemingly trivial contribution to the mass measurement, might play a predominant role in terms of toxicity evaluation.

미세 나노 플라스틱, 비직교성 통해 오염원 추적·방지 가능

또한 입자 크기 분포는 화학적 조성에 따라 달라지는데 이는 입자 형태와 화학적 조성 사이의 상호 연관성을 시사한다. 플라스틱 조성과 입자 형태 사이에서 관찰된 비직교성은 앙상블 측정에서 마이크로 나노 플라스틱 특성화에 대한 기존 가설과는 다르다. 

C 브랜드 생수의 분석 결과를 예로 들면 미세 나노 플라스틱의 앙상블 측정에서 PET는 구성 분석에서 주요 물질이며, 형태학적 분석에서 대부분의 플라스틱 입자가 500nm 미만의 크기를 가진다고 시사하지만 단일 입자 분석 결과는 미크론 크기의 PET 입자는 소량, 500nm 이하 크기의 PS 입자는 다량 포함되어 있다.

이러한 비직교성은 미세 나노 플라스틱의 오염원을 이해하고 추적, 방지하는 데 귀중한 정보를 제공할 수 있다. 특히, 음용수 생산에서 플라스틱 오염은 관정에서 병까지 모든 단계에서 확인된다. 서로 다른 플라스틱 폴리머 사이에서 발견된 크기 차이는 물생산 중 오염원에 대한 정보를 나타낼 수 있다. 예를 들어 연구팀이 분석한 3종의 브랜드 모두 생수 포장 재료로 사용되는 PET와 PE는 유사한 크기 분포 패턴을 가지며, 미크론 크기에서 다른 폴리머에 비해 더 많이 발견됐다. 

이는 운송 및 보관 과정에서 이러한 종류의 입자가 병에서 떨어져 나온다는 것을 시사한다. PA, PP, PS 및 PVC와 같은 포장재는 아니지만 상당한 숫자로 확인된 다른 폴리머는 물 생산 전 또는 도중에 유입될 가능성이 가장 높다. 동일한 크기 분포를 보이는 PP와 PA는 수처리 장비 및 응집 보조제로 사용된다. 특히, PA는 역삼투압에 사용되는 가장 일반적인 막 소재이다. PVC와 PS는 다른 종류보다 크기가 작은 경우가 많았다. PVC는 미세 플라스틱 분석에서 원수에 가장 많은 풍부한 고분자 종류인 것으로 확인됐으며, PS는 정수에서 이온 교화 수지의 중추 재료로 사용되는 것으로 알려져 있다. PVC나 PS의 큰 입자는 수처리 단계에서 역삼투압 막에 의해 제거돼 대부분의 나노 크기는 물속에 남아 있을 수 있다.

입자의 형태와 화학적 조성 사이의 상호 연결성은 독성학적 문제에 큰 영향을 미친다. 미세 나노 입자에 의해 유발되는 독성은 용량 의존적일 뿐만 아니라 입자의 물리화학적 특성과 세포와의 상호작용 및 흡수에 미치는 영향에도 관련이 있다. 

C 브랜드 생수의 경우, PS 나노 플라스틱과 소량의 PET 미세 플라스틱에 의해 유발되는 세포독성은 PET 나노 입자에서 가정한 효과와 다를 것으로 추정된다. 미세 나노 플라스틱에 대한 포괄적인 독성 평가는 플라스틱 입자의 다차원적 특성화와 화학적 조성 및 입자 형태에 대한 다양한 특성에 개별 플라스틱 입자의 통합이 필요하다. 

나노 입자 감도와 플라스틱 특이성을 가진 단일 입자 이미징은 이러한 독성 문제를 해결하는 데 필수적인 정보를 제공한다. 노출 수준을 정확히 정량화하면 플라스틱 입자 프로파일링을 가능하게 할 뿐만 아니라 입자-생물학적 상호작용을 직접 시각화할 수 있는 특유의 잠재력을 가지고 있다. 따라서 데이터 기반 초분광 SRS 이미징 플랫폼이 확장된 스펙트럼 라이브러리를 통해 나노 수준의 플라스틱 오염에 대한 지식 격차를 지속적으로 해소해 보다 복잡한 생물학적 및 환경 시료를 연구할 수 있을 것으로 예상된다.

Another important insight is that the particle size distribution varies with the different chemical compositions, suggesting an interconnection between particle morphology and chemical composition. The observed nonorthogonality between plastic composition and particle morphologies challenges the conventional assumption for micro-nano plastics characterization from ensemble measurement. Take the result from brand C analysis as an example, ensemble measurement of micro-nano plastics might suggest that the major substance is PET from compositional analysis and most of the plastic particles have sizes below 500 nm from the morphological analysis. Assuming the two dimensions as being independent properties, people might have an impression that most of the plastic particles in the bottled water from brand C should be PET particles with a size below 500 nm. However, our result from single-particle analysis presents a clear disparity: the sample turns out to contain a small number of PET particles of about micron size and a large number of PS particles with size below 500 nm.

Such nonorthogonality might provide valuable information to understand, trace, and eventually prevent possible sources of micro-nano plastic contamination. Specifically in drinking water production, plastic contamination is confirmed in every step from the well to the bottle. The discovered size differences among different plastic polymers might indicate precious information about contamination sources during water production. For example, PET and PE, which are used as the packaging material for bottled water for all three brands we analyzed, have similar size distribution patterns, with a major population of micron sizes compared to other polymers. A possible explanation is that some particles of this kind are newly released from the bottle package during transportation or storage, which are retained faithfully in the water sample. 

Other polymers such as PA, PP, PS, and PVC, which are not the packaging material but also identified with significant numbers, are most likely introduced before or during water production. PP and PA, which share the same broad distribution of sizes, are widely used as equipment components or coagulant aids in water treatment. Particularly, PA is the most popular membrane material used in reverse osmosis, which is a common water purification method shared by all three brands. PVC and PS, which have a unique size distribution favoring small nanoplastics, might indicate a contamination source even earlier. PVC is identified to be the most abundant polymer type in raw water from microplastic analysis. PS is known to be used as backbone material for ion exchange resins in water purification. It is possible large particles of PVC or PS get removed by the RO membranes in the later step of the water treatment, leaving mostly nano populations.

Lastly, the interconnection between particle morphology and chemical composition has profound implications for toxicological concerns. As studies with engineered nanoparticles have suggested and investigations of plastic particles are starting to indicate, toxicity induced by micro-nano particles is not only dose-dependent but also related to particle physicochemical characteristics and their effect on cellular interactions and uptake. In the case of bottled water from brand C, the cytotoxicity induced by PS nanoplastics plus a small number of PET microplastics would be presumably different from the effect assumed from PET nanoparticles. 

True comprehensive toxicity evaluation for micro-nano plastics would require multidimensional characterization of plastic particles and the integration of each individual plastic particle regarding their divergent properties on chemical composition and particle morphologies. Single-particle imaging with nanoparticle sensitivity and plastic specificity provides indispensable information to address the rising toxicity concern. Not only it enables plastic particle profiling with accurate exposure quantification, but also it has a unique potential to directly visualize the particle-biology interactions. Therefore, we envision that the data-driven hyperspectral SRS imaging platform will continue bridging the gap of knowledge on plastic pollution at the nano level with an expanded spectral library to study more complicated biological and environmental samples.  

※ ‌ 이 연구는 컬럼비아 기후대학교(Columbia Climate School) 화학부의 신가오(Xin Gao)와 샤오치 랑(Xiaoqi Lang)과 라몬트-도허티(Lamont-Doherty) 지구관측소의 하이펑 덩(Huipeng Deng) 및 테오도라 마리아 브라투(Teodora Maria Bratu), 그리고 컬럼비아대 메일맨공중보건학교(Columbia’s Mailman School of Public Health)의 취수안 첸(Qixuan Chen), 러트거대학교(Rutgers University)의 피비 스테이플턴(Phoebe Stapleton) 등이 공동 연구 및 연구결과를 공동으로 집필했다.

[출처 = 컬럼비아 기후대학교(Columbia Climate School)(https://news.climate.columbia.edu/2024/01/08/bottled-water-can-contain-hundreds-of-thousands-of-previously-uncounted-tiny-plastic-bits-study-finds/) / 2024년 1월 8일자 보도자료]

[연구논문출처 = 국립과학원회보(Proceedings of the National Academy of Sciences, PNS)(https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2300582121) / 2024년 1월 8일자 게재 논문]

[『워터저널』 2024년 2월호에 게재]